大鼠低氧誘導因子1α(HIF-1α)酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
實驗原理：
大鼠(shu)低氧誘導因子1α(HIF-1α)試(shi)劑盒含量是固相夾心法酶聯(lian)免疫吸附實驗（ELISA）.已知(zhi)待測物(wu)質濃(nong)度(du)的(de)(de)(de)(de)標準品、未知(zhi)濃(nong)度(du)的(de)(de)(de)(de)樣品加(jia)入微孔酶標板內進行檢(jian)測。先將待測物(wu)質和(he)生物(wu)素標記的(de)(de)(de)(de)抗體同(tong)時(shi)溫育(yu)。洗滌(di)后(hou)(hou)，加(jia)入親和(he)素標記過(guo)(guo)的(de)(de)(de)(de)HRP。再經過(guo)(guo)溫育(yu)和(he)洗滌(di)，去除未結(jie)(jie)合(he)的(de)(de)(de)(de)酶結(jie)(jie)合(he)物(wu)，然后(hou)(hou)加(jia)入底物(wu)A、B，和(he)酶結(jie)(jie)合(he)物(wu)同(tong)時(shi)作(zuo)用(yong)。產生顏(yan)色(se)(se)。顏(yan)色(se)(se)的(de)(de)(de)(de)深(shen)淺和(he)樣品中待測物(wu)質的(de)(de)(de)(de)濃(nong)度(du)呈(cheng)比例關系(xi)。
試劑盒組成：
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試劑盒組成
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48孔配置
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96孔配置
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保存
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說明書
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1份
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1份
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封板膜
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2片（48）
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2片（96）
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密封袋
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1個
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1個
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酶標包被板
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1×48
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1×96
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2-8℃保存
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標準品
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0.5ml×1瓶
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0.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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標準品稀釋液
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1.5ml×1瓶
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1.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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酶標試劑
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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樣品稀釋液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑A液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑B液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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終止液
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3ml×1瓶
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6ml×1瓶
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2-8℃保存
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濃縮洗滌液
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（20ml×20倍）×1瓶
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（20ml×30倍）×1瓶
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2-8℃保存
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注(zhu)：標準(zhun)(zhun)品用標準(zhun)(zhun)品稀(xi)釋(shi)液(ye)依次做倍比(bi)稀(xi)釋(shi)
標本要求：
1．標(biao)本(ben)采集后盡早(zao)進行提(ti)取(qu)，提(ti)取(qu)按(an)相關文獻(xian)進行，提(ti)取(qu)后應盡快進行實驗。若不(bu)能馬上(shang)進行試驗，可(ke)將標(biao)本(ben)放于-20℃保存，但(dan)應避免反復凍融
2．不能檢(jian)測含NaN3的樣品，因NaN3抑(yi)制(zhi)辣根過氧(yang)化物酶的（HRP）活性。
操作步驟:
1.加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)：標準(zhun)品(pin)(pin)(pin)設(she)定(ding)5個濃(nong)度(du)點(dian)10個孔(kong)，每個濃(nong)度(du)設(she)定(ding)平行孔(kong)，加(jia)(jia)(jia)入50微升不同(tong)濃(nong)度(du)的標準(zhun)品(pin)(pin)(pin)，空白孔(kong)設(she)定(ding)1個孔(kong)加(jia)(jia)(jia)入50微升蒸(zheng)餾(liu)水(shui)（空白對照(zhao)孔(kong)不加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)及酶(mei)標試(shi)劑(ji)，其余各步操(cao)作相同(tong)）、待(dai)測(ce)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)孔(kong)，在酶(mei)標包被(bei)板上待(dai)測(ce)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)孔(kong)中先加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)稀(xi)釋(shi)液40μl，然后再(zai)加(jia)(jia)(jia)待(dai)測(ce)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)10μl（樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)最終(zhong)稀(xi)釋(shi)度(du)為(wei)5倍）。加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)(yang)將樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)加(jia)(jia)(jia)于酶(mei)標板孔(kong)底部，盡量不觸(chu)及孔(kong)壁，輕輕晃動混(hun)勻。
2.溫育(yu)：用封板(ban)膜封板(ban)后置37℃溫育(yu)30分鐘。
3.配液：將30（48T的20倍(bei)）倍(bei)濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍(bei)）倍(bei)稀釋后備用。
4.洗滌(di)(di)：小心(xin)揭(jie)掉封(feng)板膜，棄(qi)去液(ye)體，甩(shuai)干，每孔加滿洗滌(di)(di)液(ye)，靜置30秒后棄(qi)去，如此重復5次，拍(pai)干。
5.加酶(mei)(mei)：每(mei)孔加入酶(mei)(mei)標試劑50μl，空白孔除外。
6.溫育：操作同(tong)2。
7.洗滌：操作(zuo)同4。
8.顯色(se)：每孔先(xian)加(jia)入(ru)顯色(se)劑A50μl，再加(jia)入(ru)顯色(se)劑B50μl，輕(qing)輕(qing)震蕩混勻，37℃避光顯色(se)15分鐘(zhong).
9.終(zhong)止(zhi)：每孔加(jia)終(zhong)止(zhi)液50μl，終(zhong)止(zhi)反應（此時藍色立轉黃色）。
10.測定(ding)：以(yi)空白空調零(ling)，450nm波長依(yi)序測量各孔的(de)吸光度（OD值）。測定(ding)應(ying)在(zai)加終(zhong)止液(ye)后15分鐘以(yi)內進行。
注意事項：
1．試劑盒從冷藏環境中取出應(ying)(ying)在(zai)室溫平(ping)衡15-30分鐘后方可使(shi)用，酶標包被板(ban)開封后如(ru)未用完，板(ban)條應(ying)(ying)裝入密封袋中保存。
2．濃洗(xi)(xi)滌(di)液(ye)可能(neng)會(hui)有結晶(jing)析出，稀(xi)釋時(shi)可在水浴中加(jia)溫(wen)助溶(rong)，洗(xi)(xi)滌(di)時(shi)不(bu)影響結果。
3．各步加(jia)樣(yang)均應使(shi)用(yong)(yong)加(jia)樣(yang)器，并(bing)經(jing)常校對其準確性，以避(bi)免試驗(yan)誤(wu)差。一次加(jia)樣(yang)時間最好(hao)控制(zhi)在5分鐘內，如標本(ben)數(shu)量多(duo)，推(tui)薦使(shi)用(yong)(yong)排槍加(jia)樣(yang)。
4．請每次測(ce)定的同時做(zuo)(zuo)標準曲線，最好做(zuo)(zuo)復(fu)孔。如標本中待(dai)測(ce)物質(zhi)含量過高(gao)（樣本OD值大于(yu)標準品(pin)孔第一(yi)孔的OD值），請先用(yong)樣品(pin)稀釋(shi)液(ye)稀釋(shi)一(yi)定倍數（n倍）后再測(ce)定，計算(suan)時請最后乘(cheng)以總稀釋(shi)倍數（×n×5）。
5．封板膜只限(xian)一次(ci)性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存(cun)。
7．嚴(yan)格按照說(shuo)明書的操作進(jin)行(xing)，試驗結果判(pan)定必須以(yi)酶(mei)標儀讀數為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按(an)傳染物處(chu)理。
9．本試劑不(bu)同批(pi)號組分不(bu)得混用(yong)。
11.如與(yu)英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算：
以標(biao)(biao)準(zhun)物的濃(nong)度為橫(heng)坐標(biao)(biao)，OD值為縱坐標(biao)(biao)，在坐標(biao)(biao)紙上繪出標(biao)(biao)準(zhun)曲線(xian)，根據樣品的OD
值(zhi)由標(biao)準(zhun)曲線查(cha)出(chu)相(xiang)應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標(biao)準(zhun)物的濃度與OD值(zhi)計算出(chu)標(biao)
準曲(qu)線的(de)直線回(hui)歸方程(cheng)式，將(jiang)樣品(pin)(pin)的(de)OD值代入方程(cheng)式，計算(suan)出樣品(pin)(pin)濃度(du)，再乘(cheng)以稀釋
倍數，即為樣品(pin)的實際濃度。
試劑(ji)盒性(xing)能：
1.樣品線性回歸與預期(qi)濃度相關系數R值為0.990以(yi)上(shang)。
2.批內與(yu)批間應分別小(xiao)于9%和11%
保存(cun)條(tiao)件及(ji)有(you)效(xiao)期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月
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