人低氧誘導因子1α(HIF-1α)酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
實驗原理：
人低氧(yang)誘導因子1α(HIF-1α)試劑盒含量是固(gu)相夾心(xin)法(fa)酶(mei)(mei)聯免(mian)疫吸附實驗（ELISA）.已知待測(ce)物質(zhi)濃度的標準品、未知濃度的樣(yang)品加(jia)入微孔酶(mei)(mei)標板(ban)內進行檢測(ce)。先將待測(ce)物質(zhi)和(he)(he)生(sheng)物素標記的抗(kang)體同時溫(wen)育。洗滌(di)后(hou)，加(jia)入親(qin)和(he)(he)素標記過的HRP。再經過溫(wen)育和(he)(he)洗滌(di)，去除未結合(he)的酶(mei)(mei)結合(he)物，然后(hou)加(jia)入底(di)物A、B，和(he)(he)酶(mei)(mei)結合(he)物同時作用。產(chan)生(sheng)顏色。顏色的深淺和(he)(he)樣(yang)品中待測(ce)物質(zhi)的濃度呈比例關系。
試劑盒組成：
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試劑盒組成
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48孔配置
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96孔配置
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保存
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說明書
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1份
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1份
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封板膜
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2片（48）
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2片（96）
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密封袋
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1個
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1個
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酶標包被板
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1×48
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1×96
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2-8℃保存
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標準品
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0.5ml×1瓶
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0.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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標準品稀釋液
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1.5ml×1瓶
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1.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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酶標試劑
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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樣品稀釋液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑A液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑B液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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終止液
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3ml×1瓶
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6ml×1瓶
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2-8℃保存
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濃縮洗滌液
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（20ml×20倍）×1瓶
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（20ml×30倍）×1瓶
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2-8℃保存
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注：標(biao)準品(pin)用標(biao)準品(pin)稀(xi)釋液(ye)依次做倍比稀(xi)釋
標本要求：
1．標本(ben)采集后(hou)盡早進行提(ti)取(qu)，提(ti)取(qu)按相(xiang)關文獻進行，提(ti)取(qu)后(hou)應盡快進行實驗。若不能馬(ma)上進行試驗，可將標本(ben)放(fang)于-20℃保存，但(dan)應避免反復凍(dong)融
2．不能檢測(ce)含(han)NaN3的樣品，因NaN3抑制辣(la)根過氧化(hua)物酶的（HRP）活性。
操作步驟:
1.加(jia)樣：標(biao)準品(pin)(pin)設(she)定5個(ge)(ge)濃度(du)點(dian)10個(ge)(ge)孔(kong)(kong)，每個(ge)(ge)濃度(du)設(she)定平(ping)行(xing)孔(kong)(kong)，加(jia)入50微升不(bu)同(tong)濃度(du)的標(biao)準品(pin)(pin)，空(kong)白孔(kong)(kong)設(she)定1個(ge)(ge)孔(kong)(kong)加(jia)入50微升蒸餾(liu)水（空(kong)白對照孔(kong)(kong)不(bu)加(jia)樣品(pin)(pin)及(ji)酶標(biao)試劑，其余(yu)各步(bu)操作相同(tong)）、待(dai)(dai)測樣品(pin)(pin)孔(kong)(kong)，在酶標(biao)包被(bei)板上(shang)待(dai)(dai)測樣品(pin)(pin)孔(kong)(kong)中先加(jia)樣品(pin)(pin)稀釋液40μl，然后再加(jia)待(dai)(dai)測樣品(pin)(pin)10μl（樣品(pin)(pin)最終(zhong)稀釋度(du)為5倍）。加(jia)樣將樣品(pin)(pin)加(jia)于酶標(biao)板孔(kong)(kong)底部(bu)，盡量(liang)不(bu)觸及(ji)孔(kong)(kong)壁，輕(qing)輕(qing)晃(huang)動(dong)混勻。
2.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
3.配液：將(jiang)30（48T的20倍(bei)）倍(bei)濃縮洗滌液用蒸餾水(shui)30（48T的20倍(bei)）倍(bei)稀釋后(hou)備用。
4.洗(xi)滌：小心(xin)揭掉封板膜，棄去液(ye)體，甩干(gan)，每孔加滿洗(xi)滌液(ye)，靜置30秒后棄去，如此(ci)重復5次，拍干(gan)。
5.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空(kong)白孔除(chu)外。
6.溫育：操作同(tong)2。
7.洗滌：操作同(tong)4。
8.顯(xian)色(se)(se)：每孔先加(jia)入(ru)顯(xian)色(se)(se)劑A50μl，再加(jia)入(ru)顯(xian)色(se)(se)劑B50μl，輕輕震蕩(dang)混勻，37℃避光顯(xian)色(se)(se)15分鐘.
9.終(zhong)止：每孔加終(zhong)止液50μl，終(zhong)止反應（此時藍色立轉黃色）。
10.測定：以空(kong)白空(kong)調零(ling)，450nm波長(chang)依序測量各孔(kong)的吸光度（OD值）。測定應在加終止液(ye)后(hou)15分鐘以內進行。
注意事項：
1．試劑盒從冷藏環境中取出(chu)應(ying)在(zai)室溫(wen)平衡(heng)15-30分鐘后(hou)方(fang)可使(shi)用，酶(mei)標包被板開(kai)封后(hou)如(ru)未用完(wan)，板條應(ying)裝入密封袋中保存(cun)。
2．濃洗(xi)滌(di)液(ye)可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中(zhong)加(jia)溫助溶，洗(xi)滌(di)時不影響(xiang)結果(guo)。
3．各步加(jia)樣(yang)(yang)(yang)均應(ying)使用加(jia)樣(yang)(yang)(yang)器，并經常校(xiao)對其(qi)準確性，以避免(mian)試(shi)驗誤差。一次加(jia)樣(yang)(yang)(yang)時間最好控制在5分(fen)鐘(zhong)內，如標本(ben)數(shu)量多，推(tui)薦使用排(pai)槍(qiang)加(jia)樣(yang)(yang)(yang)。
4．請每次測定(ding)(ding)的同(tong)時(shi)做(zuo)標(biao)準曲線(xian)，最好做(zuo)復孔。如標(biao)本中待(dai)測物(wu)質含(han)量過高（樣(yang)(yang)本OD值(zhi)大于標(biao)準品孔第(di)一孔的OD值(zhi)），請先用樣(yang)(yang)品稀(xi)釋(shi)液稀(xi)釋(shi)一定(ding)(ding)倍數（n倍）后再測定(ding)(ding)，計算時(shi)請最后乘以總稀(xi)釋(shi)倍數（×n×5）。
5．封板膜只(zhi)限一(yi)次性使用，以避免交(jiao)叉(cha)污染(ran)。
6．底物請(qing)避光保存。
7．嚴格(ge)按照說明(ming)書(shu)的操作進行，試驗(yan)結果判(pan)定(ding)必須以(yi)酶標儀讀(du)數為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物(wu)都應按傳染物(wu)處(chu)理。
9．本(ben)試劑不(bu)同批(pi)號組分不(bu)得混用。
11.如(ru)與英文說明(ming)書有異，以英文說明(ming)書為準。
計算：
以標(biao)準(zhun)物的濃度為(wei)橫坐標(biao)，OD值(zhi)為(wei)縱(zong)坐標(biao)，在坐標(biao)紙上繪出標(biao)準(zhun)曲線，根據樣品(pin)的OD
值由標準(zhun)曲線查出相應的濃度(du)；再乘以稀釋倍數；或(huo)用標準(zhun)物(wu)的濃度(du)與OD值計算出標
準曲線(xian)(xian)的(de)直線(xian)(xian)回歸方程式(shi)，將樣(yang)(yang)品的(de)OD值(zhi)代入方程式(shi)，計算出樣(yang)(yang)品濃度，再乘以(yi)稀釋(shi)
倍(bei)數，即為樣品的實際濃(nong)度。
試劑盒(he)性能：
1.樣品線性回歸與預(yu)期濃度相(xiang)關(guan)系數R值為0.990以上。
2.批(pi)內與批(pi)間應分(fen)別小于9%和11%
保存條件及(ji)有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月(yue)
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