大鼠糖化血紅蛋白A1c(GHbA1c)酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
實驗原理：
大(da)鼠糖化血紅蛋白A1c(GHbA1c)試劑盒含量(liang)是(shi)固相夾心法酶(mei)聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知(zhi)待測(ce)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)濃度(du)的(de)標準品(pin)、未(wei)知(zhi)濃度(du)的(de)樣品(pin)加入(ru)微孔酶(mei)標板內進行(xing)檢測(ce)。先將待測(ce)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)和(he)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素標記的(de)抗體同時溫(wen)育(yu)。洗(xi)滌(di)后，加入(ru)親和(he)素標記過的(de)HRP。再經過溫(wen)育(yu)和(he)洗(xi)滌(di)，去除未(wei)結合的(de)酶(mei)結合物(wu)(wu)(wu)，然后加入(ru)底(di)物(wu)(wu)(wu)A、B，和(he)酶(mei)結合物(wu)(wu)(wu)同時作用。產生(sheng)顏色(se)。顏色(se)的(de)深淺和(he)樣品(pin)中(zhong)待測(ce)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)的(de)濃度(du)呈(cheng)比例(li)關系(xi)。
試劑盒組成：
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試劑盒組成
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48孔配置
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96孔配置
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保存
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說明書
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1份
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1份
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封板膜
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2片（48）
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2片（96）
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密封袋
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1個
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1個
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酶標包被板
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1×48
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1×96
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2-8℃保存
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標準品
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0.5ml×1瓶
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0.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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標準品稀釋液
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1.5ml×1瓶
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1.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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酶標試劑
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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樣品稀釋液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑A液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑B液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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終止液
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3ml×1瓶
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6ml×1瓶
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2-8℃保存
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濃縮洗滌液
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（20ml×20倍）×1瓶
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（20ml×30倍）×1瓶
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2-8℃保存
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注：標準品(pin)用標準品(pin)稀(xi)釋液依(yi)次做倍(bei)比稀(xi)釋
標本要求：
1．標本采集(ji)后(hou)盡早進(jin)(jin)行提取(qu)，提取(qu)按(an)相關文獻進(jin)(jin)行，提取(qu)后(hou)應盡快進(jin)(jin)行實驗。若(ruo)不能馬上進(jin)(jin)行試驗，可將標本放于-20℃保(bao)存，但(dan)應避(bi)免(mian)反復(fu)凍融
2．不能檢測(ce)含NaN3的(de)樣品，因NaN3抑制辣根過氧化(hua)物酶的(de)（HRP）活(huo)性。
操作步驟:
1.加樣(yang)：標(biao)準品(pin)設(she)(she)定(ding)5個(ge)濃度(du)點10個(ge)孔(kong)，每個(ge)濃度(du)設(she)(she)定(ding)平(ping)行(xing)孔(kong)，加入50微(wei)升(sheng)(sheng)不同濃度(du)的標(biao)準品(pin)，空白孔(kong)設(she)(she)定(ding)1個(ge)孔(kong)加入50微(wei)升(sheng)(sheng)蒸餾水（空白對照孔(kong)不加樣(yang)品(pin)及酶標(biao)試劑，其余各步操作相同）、待測(ce)(ce)樣(yang)品(pin)孔(kong)，在酶標(biao)包被板(ban)上(shang)待測(ce)(ce)樣(yang)品(pin)孔(kong)中先加樣(yang)品(pin)稀釋液40μl，然后再加待測(ce)(ce)樣(yang)品(pin)10μl（樣(yang)品(pin)最終(zhong)稀釋度(du)為5倍(bei)）。加樣(yang)將樣(yang)品(pin)加于酶標(biao)板(ban)孔(kong)底部，盡量不觸及孔(kong)壁，輕輕晃動混(hun)勻。
2.溫(wen)育：用封板(ban)膜(mo)封板(ban)后置37℃溫(wen)育30分(fen)鐘。
3.配(pei)液：將30（48T的20倍(bei)）倍(bei)濃縮洗滌液用蒸餾水(shui)30（48T的20倍(bei)）倍(bei)稀釋后備用。
4.洗滌(di)：小心揭掉封板(ban)膜，棄(qi)(qi)去液體，甩干(gan)，每孔加滿洗滌(di)液，靜置(zhi)30秒后(hou)棄(qi)(qi)去，如此(ci)重復5次，拍干(gan)。
5.加(jia)酶：每(mei)孔加(jia)入酶標試劑50μl，空白(bai)孔除外(wai)。
6.溫(wen)育(yu)：操作同2。
7.洗(xi)滌(di)：操作同(tong)4。
8.顯(xian)色(se)：每孔先加(jia)入顯(xian)色(se)劑A50μl，再加(jia)入顯(xian)色(se)劑B50μl，輕(qing)輕(qing)震蕩混勻，37℃避光顯(xian)色(se)15分(fen)鐘.
9.終止(zhi)：每孔加終止(zhi)液50μl，終止(zhi)反應（此時藍色(se)立轉黃色(se)）。
10.測定(ding)：以空白空調(diao)零，450nm波長依(yi)序測量(liang)各(ge)孔的吸光度(du)（OD值(zhi)）。測定(ding)應(ying)在加終止液后(hou)15分鐘以內進行。
注意事項：
1．試劑(ji)盒從冷(leng)藏環(huan)境中取出應在室溫(wen)平衡15-30分鐘后(hou)方可使(shi)用，酶標包(bao)被(bei)板開封(feng)后(hou)如未用完，板條應裝(zhuang)入密封(feng)袋中保存。
2．濃(nong)洗滌液可能(neng)會有結晶(jing)析出，稀釋時可在水(shui)浴(yu)中加溫助溶(rong)，洗滌時不影響(xiang)結果。
3．各步加樣(yang)均應(ying)使(shi)用加樣(yang)器，并經常校對其(qi)準確性，以避免試驗(yan)誤差(cha)。一(yi)次加樣(yang)時間最好(hao)控制在5分鐘內，如標(biao)本數量多(duo)，推薦使(shi)用排槍加樣(yang)。
4．請(qing)每(mei)次測(ce)定的同(tong)時做標準曲線，最好(hao)做復(fu)孔。如標本中待(dai)測(ce)物質含量(liang)過高(gao)（樣本OD值(zhi)大于標準品孔第一孔的OD值(zhi)），請(qing)先用(yong)樣品稀釋液稀釋一定倍(bei)數(shu)（n倍(bei)）后再測(ce)定，計算時請(qing)最后乘(cheng)以總稀釋倍(bei)數(shu)（×n×5）。
5．封板膜只限一(yi)次性使(shi)用，以避免交叉(cha)污染。
6．底物(wu)請避(bi)光(guang)保存。
7．嚴格按照說(shuo)明(ming)書(shu)的操(cao)作(zuo)進行，試驗結果判定必須以酶(mei)標儀讀(du)數為準.
8．所有樣(yang)品，洗(xi)滌(di)液和各種廢棄物(wu)都應按傳(chuan)染(ran)物(wu)處(chu)理。
9．本試劑不同(tong)批號組分不得混用。
11.如與英文(wen)說明書有異，以英文(wen)說明書為(wei)準。
計算：
以標準物的(de)濃(nong)度為(wei)橫坐(zuo)標，OD值為(wei)縱坐(zuo)標，在坐(zuo)標紙上繪出標準曲線，根據樣品(pin)的(de)OD
值(zhi)由標(biao)準(zhun)(zhun)曲線查出相應的(de)濃(nong)度(du)；再乘以稀釋倍數；或用標(biao)準(zhun)(zhun)物(wu)的(de)濃(nong)度(du)與OD值(zhi)計算出標(biao)
準曲線的直線回(hui)歸(gui)方(fang)程(cheng)式，將樣品的OD值代入方(fang)程(cheng)式，計算出樣品濃(nong)度，再乘以稀釋
倍數，即為樣(yang)品的實際濃(nong)度。
試劑盒性能：
1.樣品線(xian)性回歸與預(yu)期濃度相關系數(shu)R值為0.990以上(shang)。
2.批內與(yu)批間應分別小(xiao)于9%和11%
保(bao)存條件(jian)及有(you)效期：
1.試劑(ji)盒保存：；2-8℃。
2．有(you)效期：6個月
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