人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
實驗原理：
人(ren)肝素輔(fu)因子Ⅱ(HCⅡ)試劑盒(he)含量是固相夾(jia)心法酶(mei)聯免疫吸附(fu)實驗（ELISA）.已知(zhi)(zhi)待測物(wu)(wu)(wu)質(zhi)濃度(du)的標(biao)準品、未知(zhi)(zhi)濃度(du)的樣品加入微孔酶(mei)標(biao)板(ban)內進行檢(jian)測。先將待測物(wu)(wu)(wu)質(zhi)和(he)(he)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素標(biao)記(ji)的抗體同時(shi)溫(wen)育(yu)。洗(xi)滌(di)后(hou)，加入親和(he)(he)素標(biao)記(ji)過(guo)的HRP。再經過(guo)溫(wen)育(yu)和(he)(he)洗(xi)滌(di)，去除未結(jie)合的酶(mei)結(jie)合物(wu)(wu)(wu)，然后(hou)加入底物(wu)(wu)(wu)A、B，和(he)(he)酶(mei)結(jie)合物(wu)(wu)(wu)同時(shi)作用。產生(sheng)(sheng)顏色(se)。顏色(se)的深淺(qian)和(he)(he)樣品中(zhong)待測物(wu)(wu)(wu)質(zhi)的濃度(du)呈(cheng)比例關系。
試劑盒組成：
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試劑盒組成
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48孔配置
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96孔配置
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保存
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說明書
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1份
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1份
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封板膜
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2片（48）
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2片（96）
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密封袋
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1個
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1個
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酶標包被板
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1×48
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1×96
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2-8℃保存
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標準品
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0.5ml×1瓶
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0.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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標準品稀釋液
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1.5ml×1瓶
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1.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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酶標試劑
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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樣品稀釋液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑A液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑B液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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終止液
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3ml×1瓶
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6ml×1瓶
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2-8℃保存
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濃縮洗滌液
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（20ml×20倍）×1瓶
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（20ml×30倍）×1瓶
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2-8℃保存
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注：標準品用標準品稀釋(shi)(shi)液依次做倍比稀釋(shi)(shi)
標本要求：
1．標本采集后盡早進(jin)(jin)行(xing)提取(qu)(qu)，提取(qu)(qu)按相(xiang)關(guan)文獻進(jin)(jin)行(xing)，提取(qu)(qu)后應(ying)(ying)盡快(kuai)進(jin)(jin)行(xing)實驗。若不能馬上進(jin)(jin)行(xing)試驗，可將標本放于(yu)-20℃保存，但應(ying)(ying)避(bi)免反復凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品(pin)，因NaN3抑制辣根(gen)過(guo)氧化物酶(mei)的（HRP）活性。
操作步驟:
1.加(jia)樣(yang)(yang)：標(biao)準(zhun)品(pin)(pin)設(she)定5個(ge)濃度(du)點10個(ge)孔(kong)，每個(ge)濃度(du)設(she)定平(ping)行孔(kong)，加(jia)入50微升(sheng)不(bu)(bu)同濃度(du)的標(biao)準(zhun)品(pin)(pin)，空白(bai)孔(kong)設(she)定1個(ge)孔(kong)加(jia)入50微升(sheng)蒸(zheng)餾水（空白(bai)對照孔(kong)不(bu)(bu)加(jia)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)及(ji)酶(mei)標(biao)試劑，其余各步操作相同）、待測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)孔(kong)，在酶(mei)標(biao)包被板上待測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)孔(kong)中先加(jia)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)稀(xi)釋液40μl，然后再加(jia)待測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)10μl（樣(yang)(yang)品(pin)(pin)最終稀(xi)釋度(du)為(wei)5倍）。加(jia)樣(yang)(yang)將樣(yang)(yang)品(pin)(pin)加(jia)于酶(mei)標(biao)板孔(kong)底部，盡量不(bu)(bu)觸及(ji)孔(kong)壁，輕輕晃動混勻。
2.溫育(yu)(yu)：用封板(ban)膜(mo)封板(ban)后(hou)置(zhi)37℃溫育(yu)(yu)30分(fen)鐘。
3.配液(ye)：將30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)濃(nong)縮洗滌液(ye)用蒸餾水30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)稀釋后(hou)備用。
4.洗滌：小(xiao)心(xin)揭掉(diao)封板膜(mo)，棄去液體，甩(shuai)干，每(mei)孔加滿洗滌液，靜置30秒后(hou)棄去，如此重復5次，拍(pai)干。
5.加(jia)酶(mei)：每孔加(jia)入酶(mei)標試劑50μl，空白孔除(chu)外。
6.溫育(yu)：操作同2。
7.洗滌：操作同4。
8.顯色(se)：每孔先加入(ru)顯色(se)劑A50μl，再加入(ru)顯色(se)劑B50μl，輕輕震蕩(dang)混勻(yun)，37℃避光顯色(se)15分鐘.
9.終(zhong)止：每孔加(jia)終(zhong)止液(ye)50μl，終(zhong)止反(fan)應（此時藍色立(li)轉(zhuan)黃色）。
10.測定(ding)：以空白空調零，450nm波長(chang)依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定(ding)應(ying)在(zai)加終止液后15分(fen)鐘以內進行。
注意事項：
1．試劑盒(he)從冷藏環境中取出應在室溫平衡(heng)15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封(feng)后如未用完，板條(tiao)應裝入密封(feng)袋(dai)中保存(cun)。
2．濃洗滌(di)液可能會有結晶析(xi)出，稀釋(shi)時(shi)可在水浴(yu)中(zhong)加溫(wen)助(zhu)溶(rong)，洗滌(di)時(shi)不影響(xiang)結果。
3．各步加樣均應(ying)使用加樣器，并經常校對(dui)其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時(shi)間(jian)最(zui)好(hao)控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍(qiang)加樣。
4．請(qing)每次測定(ding)的同(tong)時做標(biao)準曲線，最好做復孔。如標(biao)本中待(dai)測物質含量(liang)過高（樣(yang)本OD值大于標(biao)準品孔第一(yi)孔的OD值），請(qing)先(xian)用(yong)樣(yang)品稀釋液稀釋一(yi)定(ding)倍數(shu)（n倍）后再測定(ding)，計算時請(qing)最后乘以總稀釋倍數(shu)（×n×5）。
5．封板(ban)膜只限(xian)一(yi)次性使用，以避(bi)免交叉污(wu)染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明(ming)書的操作進(jin)行，試驗結果判定(ding)必須以酶標(biao)儀讀數(shu)為(wei)準.
8．所有樣品，洗滌液(ye)和各種廢棄物都應(ying)按(an)傳染物處(chu)理。
9．本試劑不(bu)同批號組(zu)分不(bu)得(de)混(hun)用。
11.如(ru)與英文(wen)說明書有異(yi)，以(yi)英文(wen)說明書為準。
計算：
以標準物的濃度為橫坐(zuo)標，OD值為縱坐(zuo)標，在(zai)坐(zuo)標紙(zhi)上繪出標準曲線，根據(ju)樣品的OD
值(zhi)由標(biao)準曲(qu)線(xian)查出相應的濃度(du)；再乘以稀釋倍數；或用標(biao)準物的濃度(du)與OD值(zhi)計(ji)算出標(biao)
準(zhun)曲(qu)線的(de)(de)直線回(hui)歸方程(cheng)式，將樣品的(de)(de)OD值代入(ru)方程(cheng)式，計算(suan)出樣品濃度，再(zai)乘以(yi)稀釋(shi)
倍(bei)數，即為(wei)樣品的實(shi)際(ji)濃度。
試劑盒(he)性能：
1.樣品(pin)線性(xing)回歸與預期濃(nong)度相關系數R值為0.990以上。
2.批(pi)(pi)內(nei)與(yu)批(pi)(pi)間應分別小(xiao)于9%和11%
保(bao)存條件(jian)及有(you)效期：
1.試(shi)劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月
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