斑馬魚γ干擾素(IFN-γ)酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
實驗原理：
斑馬魚γ干擾素(su)(su)(IFN-γ)試劑(ji)盒含量是(shi)固(gu)相(xiang)夾心法酶(mei)聯(lian)免疫吸(xi)附實(shi)驗（ELISA）.已知(zhi)待(dai)(dai)測(ce)(ce)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)濃度(du)的(de)標(biao)(biao)(biao)(biao)準品、未知(zhi)濃度(du)的(de)樣(yang)品加入微孔(kong)酶(mei)標(biao)(biao)(biao)(biao)板內進行(xing)檢測(ce)(ce)。先將待(dai)(dai)測(ce)(ce)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)和(he)生物(wu)(wu)(wu)素(su)(su)標(biao)(biao)(biao)(biao)記的(de)抗(kang)體同時溫育。洗(xi)滌(di)后，加入親和(he)素(su)(su)標(biao)(biao)(biao)(biao)記過(guo)的(de)HRP。再經過(guo)溫育和(he)洗(xi)滌(di)，去(qu)除未結合的(de)酶(mei)結合物(wu)(wu)(wu)，然后加入底物(wu)(wu)(wu)A、B，和(he)酶(mei)結合物(wu)(wu)(wu)同時作用。產生顏色(se)。顏色(se)的(de)深淺和(he)樣(yang)品中待(dai)(dai)測(ce)(ce)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)的(de)濃度(du)呈比例關系。
試劑盒組成：
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試劑盒組成
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48孔配置
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96孔配置
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保存
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說明書
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1份
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1份
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封板膜
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2片（48）
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2片（96）
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密封袋
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1個
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1個
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酶標包被板
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1×48
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1×96
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2-8℃保存
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標準品
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0.5ml×1瓶
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0.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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標準品稀釋液
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1.5ml×1瓶
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1.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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酶標試劑
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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樣品稀釋液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑A液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑B液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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終止液
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3ml×1瓶
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6ml×1瓶
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2-8℃保存
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濃縮洗滌液
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（20ml×20倍）×1瓶
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（20ml×30倍）×1瓶
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2-8℃保存
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注：標準品用(yong)標準品稀(xi)釋液(ye)依次做倍比稀(xi)釋
標本要求：
1．標本采(cai)集后盡早進(jin)(jin)行(xing)提(ti)(ti)取，提(ti)(ti)取按相關文獻進(jin)(jin)行(xing)，提(ti)(ti)取后應盡快(kuai)進(jin)(jin)行(xing)實驗。若不能(neng)馬上進(jin)(jin)行(xing)試(shi)驗，可(ke)將標本放于-20℃保存，但應避免(mian)反復凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活(huo)性(xing)。
操作步驟:
1.加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)：標準品(pin)(pin)設(she)定5個(ge)(ge)濃度(du)點10個(ge)(ge)孔(kong)(kong)，每個(ge)(ge)濃度(du)設(she)定平行孔(kong)(kong)，加(jia)(jia)(jia)入50微(wei)升不同濃度(du)的標準品(pin)(pin)，空白(bai)孔(kong)(kong)設(she)定1個(ge)(ge)孔(kong)(kong)加(jia)(jia)(jia)入50微(wei)升蒸餾水（空白(bai)對照孔(kong)(kong)不加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)及酶(mei)標試劑，其(qi)余各(ge)步操(cao)作(zuo)相同）、待測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)孔(kong)(kong)，在酶(mei)標包被(bei)板上待測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)孔(kong)(kong)中先加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)稀釋液(ye)40μl，然后再加(jia)(jia)(jia)待測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)10μl（樣(yang)(yang)品(pin)(pin)最(zui)終稀釋度(du)為5倍）。加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)將樣(yang)(yang)品(pin)(pin)加(jia)(jia)(jia)于酶(mei)標板孔(kong)(kong)底部(bu)，盡量不觸及孔(kong)(kong)壁(bi)，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)晃動混勻。
2.溫育(yu)(yu)：用(yong)封板膜封板后置(zhi)37℃溫育(yu)(yu)30分鐘。
3.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用(yong)(yong)蒸(zheng)餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備(bei)用(yong)(yong)。
4.洗(xi)滌：小心揭(jie)掉封板膜，棄去液(ye)體，甩干(gan)，每孔加滿洗(xi)滌液(ye)，靜置30秒(miao)后棄去，如此重復(fu)5次，拍干(gan)。
5.加(jia)酶：每(mei)孔(kong)加(jia)入酶標試劑50μl，空白孔(kong)除外(wai)。
6.溫育：操作同(tong)2。
7.洗滌：操作(zuo)同4。
8.顯色(se)(se)：每孔先加(jia)入(ru)顯色(se)(se)劑A50μl，再加(jia)入(ru)顯色(se)(se)劑B50μl，輕輕震(zhen)蕩混勻(yun)，37℃避光顯色(se)(se)15分鐘.
9.終止：每孔加(jia)終止液50μl，終止反應（此時(shi)藍色(se)立轉(zhuan)黃色(se)）。
10.測定：以空白(bai)空調零(ling)，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止(zhi)液后15分鐘以內進行。
注意事項：
1．試劑盒從冷藏環(huan)境中取出應在(zai)室溫平衡(heng)15-30分鐘(zhong)后(hou)方(fang)可使(shi)用(yong)，酶標包被板開封后(hou)如未用(yong)完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃(nong)洗滌液可能會有結晶析出，稀(xi)釋時可在(zai)水浴中加溫助溶，洗滌時不影響(xiang)結果。
3．各步加樣(yang)(yang)均(jun)應使用加樣(yang)(yang)器，并經常校(xiao)對其準確(que)性，以避免試驗誤差。一次加樣(yang)(yang)時間最好控(kong)制在5分鐘內，如(ru)標本數量多，推薦使用排(pai)槍(qiang)加樣(yang)(yang)。
4．請(qing)每次(ci)測(ce)定的同時做標(biao)(biao)準(zhun)曲線(xian)，最好(hao)做復孔(kong)。如標(biao)(biao)本中待測(ce)物質含量過(guo)高（樣本OD值大于標(biao)(biao)準(zhun)品孔(kong)第一(yi)孔(kong)的OD值），請(qing)先(xian)用樣品稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)液稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)一(yi)定倍數（n倍）后再測(ce)定，計算時請(qing)最后乘以總稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)倍數（×n×5）。
5．封板(ban)膜只限一次性使用，以避免交叉(cha)污染(ran)。
6．底物請避(bi)光保存。
7．嚴格按照說明書的操作(zuo)進(jin)行，試驗結果(guo)判定(ding)必須以酶標儀(yi)讀數為準(zhun).
8．所有樣品，洗滌液(ye)和各(ge)種廢棄物(wu)都應按傳染(ran)物(wu)處理(li)。
9．本試劑(ji)不同批號組分不得混用(yong)。
11.如與英文說明(ming)書有異，以英文說明(ming)書為(wei)準。
計算：
以標(biao)準物(wu)的濃度(du)為橫坐(zuo)標(biao)，OD值(zhi)為縱(zong)坐(zuo)標(biao)，在坐(zuo)標(biao)紙上繪出標(biao)準曲線(xian)，根據樣(yang)品的OD
值(zhi)(zhi)由標(biao)準曲線查出相(xiang)應的濃度(du)；再乘以稀釋倍數；或用標(biao)準物的濃度(du)與(yu)OD值(zhi)(zhi)計算出標(biao)
準曲線(xian)的直線(xian)回歸方程(cheng)式，將樣品(pin)的OD值(zhi)代(dai)入方程(cheng)式，計(ji)算出樣品(pin)濃度，再(zai)乘以(yi)稀釋(shi)
倍數，即(ji)為樣品的實際濃度。
試劑盒性能：
1.樣(yang)品(pin)線性回歸與(yu)預期濃度(du)相關系(xi)數R值為0.990以上。
2.批(pi)內與批(pi)間應分別小(xiao)于9%和(he)11%
保存條件及有效期：
1.試劑盒保(bao)存：；2-8℃。
2．有效期：6個月
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