斑馬魚白介素8（IL-8）酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
實驗原理：
斑馬魚(yu)白介素(su)(su)8（IL-8）試(shi)劑盒含量是固(gu)相夾心法(fa)酶(mei)(mei)聯(lian)免(mian)疫(yi)吸附實(shi)驗（ELISA）.已知待(dai)(dai)測(ce)物質(zhi)濃度的(de)(de)標(biao)準品、未(wei)知濃度的(de)(de)樣品加入(ru)(ru)微孔(kong)酶(mei)(mei)標(biao)板內(nei)進行(xing)檢測(ce)。先將待(dai)(dai)測(ce)物質(zhi)和(he)生物素(su)(su)標(biao)記(ji)的(de)(de)抗體(ti)同時溫育(yu)。洗(xi)滌后(hou)，加入(ru)(ru)親和(he)素(su)(su)標(biao)記(ji)過的(de)(de)HRP。再經過溫育(yu)和(he)洗(xi)滌，去除未(wei)結(jie)合(he)的(de)(de)酶(mei)(mei)結(jie)合(he)物，然(ran)后(hou)加入(ru)(ru)底物A、B，和(he)酶(mei)(mei)結(jie)合(he)物同時作用。產(chan)生顏(yan)色(se)。顏(yan)色(se)的(de)(de)深(shen)淺和(he)樣品中待(dai)(dai)測(ce)物質(zhi)的(de)(de)濃度呈比例關系。
試劑盒組成：
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試劑盒組成
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48孔配置
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96孔配置
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保存
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說明書
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1份
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1份
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封板膜
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2片（48）
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2片（96）
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密封袋
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1個
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1個
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酶標包被板
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1×48
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1×96
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2-8℃保存
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標準品
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0.5ml×1瓶
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0.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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標準品稀釋液
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1.5ml×1瓶
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1.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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酶標試劑
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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樣品稀釋液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑A液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑B液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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終止液
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3ml×1瓶
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6ml×1瓶
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2-8℃保存
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濃縮洗滌液
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（20ml×20倍）×1瓶
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（20ml×30倍）×1瓶
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2-8℃保存
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注(zhu)：標準(zhun)(zhun)品(pin)用標準(zhun)(zhun)品(pin)稀(xi)(xi)釋液依次(ci)做倍比稀(xi)(xi)釋
標本要求：
1．標(biao)本采集后盡(jin)早進(jin)行提取(qu)，提取(qu)按(an)相關(guan)文獻(xian)進(jin)行，提取(qu)后應(ying)盡(jin)快進(jin)行實驗。若不能馬上進(jin)行試驗，可(ke)將標(biao)本放(fang)于-20℃保存(cun)，但應(ying)避免(mian)反復凍融
2．不(bu)能檢測含NaN3的樣品，因(yin)NaN3抑(yi)制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟:
1.加(jia)(jia)樣(yang)：標(biao)(biao)準品(pin)(pin)(pin)設(she)(she)定(ding)5個濃度(du)點10個孔(kong)，每個濃度(du)設(she)(she)定(ding)平行孔(kong)，加(jia)(jia)入50微(wei)升(sheng)不同濃度(du)的標(biao)(biao)準品(pin)(pin)(pin)，空(kong)白孔(kong)設(she)(she)定(ding)1個孔(kong)加(jia)(jia)入50微(wei)升(sheng)蒸餾水（空(kong)白對照孔(kong)不加(jia)(jia)樣(yang)品(pin)(pin)(pin)及(ji)酶標(biao)(biao)試劑(ji)，其(qi)余各步操作相(xiang)同）、待(dai)測樣(yang)品(pin)(pin)(pin)孔(kong)，在(zai)酶標(biao)(biao)包被板上(shang)待(dai)測樣(yang)品(pin)(pin)(pin)孔(kong)中先加(jia)(jia)樣(yang)品(pin)(pin)(pin)稀(xi)釋液40μl，然后再加(jia)(jia)待(dai)測樣(yang)品(pin)(pin)(pin)10μl（樣(yang)品(pin)(pin)(pin)最終稀(xi)釋度(du)為5倍(bei)）。加(jia)(jia)樣(yang)將(jiang)樣(yang)品(pin)(pin)(pin)加(jia)(jia)于酶標(biao)(biao)板孔(kong)底部，盡量不觸及(ji)孔(kong)壁，輕輕晃動混勻。
2.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
3.配液：將(jiang)30（48T的20倍(bei)）倍(bei)濃縮(suo)洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍(bei)）倍(bei)稀釋(shi)后備用。
4.洗滌：小心(xin)揭掉封板膜，棄去(qu)液體，甩干，每孔加滿(man)洗滌液，靜置30秒后棄去(qu)，如此重復5次，拍干。
5.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空(kong)白孔除外(wai)。
6.溫育：操作同(tong)2。
7.洗滌：操作同(tong)4。
8.顯色：每孔(kong)先(xian)加入(ru)顯色劑A50μl，再加入(ru)顯色劑B50μl，輕輕震(zhen)蕩混勻，37℃避(bi)光顯色15分鐘(zhong).
9.終(zhong)(zhong)止(zhi)：每孔(kong)加終(zhong)(zhong)止(zhi)液(ye)50μl，終(zhong)(zhong)止(zhi)反應(ying)（此時藍色(se)(se)立(li)轉黃色(se)(se)）。
10.測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終(zhong)止液后15分鐘以內進(jin)行。
注意事項：
1．試(shi)劑(ji)盒從(cong)冷藏環境中取(qu)出應在室溫平衡15-30分鐘(zhong)后(hou)方可使用，酶標(biao)包(bao)被板開封后(hou)如未用完，板條(tiao)應裝入密封袋(dai)中保存(cun)。
2．濃洗滌液可(ke)能會有結晶析出，稀釋(shi)時(shi)可(ke)在水浴中加溫助溶，洗滌時(shi)不(bu)影響結果。
3．各(ge)步加(jia)樣均應使用(yong)加(jia)樣器，并經常校對其準確性，以避免(mian)試驗誤差。一次(ci)加(jia)樣時間最(zui)好控制(zhi)在(zai)5分鐘內，如標(biao)本數量多(duo)，推薦使用(yong)排槍(qiang)加(jia)樣。
4．請每次測(ce)(ce)定的同時做(zuo)標準曲(qu)線，最好(hao)做(zuo)復孔(kong)。如標本中待測(ce)(ce)物質含量過(guo)高（樣本OD值大于(yu)標準品(pin)孔(kong)第一孔(kong)的OD值），請先用樣品(pin)稀釋(shi)液稀釋(shi)一定倍(bei)數(shu)（n倍(bei)）后(hou)再測(ce)(ce)定，計算時請最后(hou)乘以總稀釋(shi)倍(bei)數(shu)（×n×5）。
5．封(feng)板膜只限一次性使用，以避免交叉(cha)污(wu)染(ran)。
6．底物(wu)請避光(guang)保存。
7．嚴格按照說明書的操(cao)作進行(xing)，試驗結果判定必須以(yi)酶標儀讀數為準(zhun).
8．所有(you)樣品，洗滌(di)液(ye)和各(ge)種廢棄(qi)物都應按傳染物處(chu)理(li)。
9．本試劑不同批號組分不得(de)混用(yong)。
11.如與(yu)英(ying)文說明書有異(yi)，以英(ying)文說明書為(wei)準。
計算：
以標(biao)(biao)準物的濃度(du)為橫坐標(biao)(biao)，OD值為縱坐標(biao)(biao)，在坐標(biao)(biao)紙上繪(hui)出標(biao)(biao)準曲線，根據樣品(pin)的OD
值由標準(zhun)曲線查出相(xiang)應的濃(nong)(nong)度；再乘以稀釋倍數；或用標準(zhun)物(wu)的濃(nong)(nong)度與(yu)OD值計算出標
準曲(qu)線的(de)直線回歸方程式(shi)(shi)，將樣(yang)品(pin)的(de)OD值代入方程式(shi)(shi)，計算出(chu)樣(yang)品(pin)濃度，再乘以稀釋
倍數，即為樣品的(de)實際濃度。
試(shi)劑盒(he)性能：
1.樣(yang)品線性回歸與預期濃(nong)度相關系數R值為0.990以上。
2.批(pi)內與批(pi)間應分別(bie)小于9%和11%
保(bao)存條(tiao)件及(ji)有效(xiao)期(qi)：
1.試劑盒(he)保(bao)存：；2-8℃。
2．有效期：6個月
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