斑馬魚白介素6（IL-6）酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
實驗原理：
斑馬魚(yu)白介素(su)6（IL-6）試(shi)劑盒(he)含量是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知待測(ce)物質(zhi)濃度的(de)標準品、未知濃度的(de)樣品加入(ru)(ru)微(wei)孔酶標板內(nei)進行檢測(ce)。先將待測(ce)物質(zhi)和(he)生(sheng)物素(su)標記的(de)抗體同(tong)時溫育(yu)。洗(xi)滌后(hou)，加入(ru)(ru)親和(he)素(su)標記過(guo)的(de)HRP。再經(jing)過(guo)溫育(yu)和(he)洗(xi)滌，去除未結合的(de)酶結合物，然后(hou)加入(ru)(ru)底物A、B，和(he)酶結合物同(tong)時作用。產生(sheng)顏色。顏色的(de)深淺和(he)樣品中待測(ce)物質(zhi)的(de)濃度呈比例關系。
試劑盒組成：
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試劑盒組成
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48孔配置
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96孔配置
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保存
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說明書
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1份
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1份
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封板膜
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2片（48）
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2片（96）
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密封袋
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1個
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1個
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酶標包被板
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1×48
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1×96
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2-8℃保存
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標準品
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0.5ml×1瓶
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0.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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標準品稀釋液
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1.5ml×1瓶
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1.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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酶標試劑
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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樣品稀釋液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑A液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑B液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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終止液
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3ml×1瓶
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6ml×1瓶
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2-8℃保存
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濃縮洗滌液
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（20ml×20倍）×1瓶
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（20ml×30倍）×1瓶
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2-8℃保存
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注：標準(zhun)品(pin)用標準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液(ye)依(yi)次做倍(bei)比稀釋(shi)
標本要求：
1．標本采集后盡早進行提(ti)取，提(ti)取按相關文獻進行，提(ti)取后應(ying)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存(cun)，但應(ying)避免(mian)反(fan)復凍融
2．不(bu)能檢測含NaN3的樣品(pin)，因NaN3抑(yi)制(zhi)辣根過氧化物(wu)酶的（HRP）活(huo)性(xing)。
操作步驟:
1.加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)：標準品(pin)設(she)定(ding)(ding)5個(ge)(ge)濃(nong)度點(dian)10個(ge)(ge)孔(kong)，每個(ge)(ge)濃(nong)度設(she)定(ding)(ding)平行孔(kong)，加(jia)(jia)(jia)入(ru)50微(wei)升(sheng)不同(tong)濃(nong)度的標準品(pin)，空(kong)白孔(kong)設(she)定(ding)(ding)1個(ge)(ge)孔(kong)加(jia)(jia)(jia)入(ru)50微(wei)升(sheng)蒸餾水（空(kong)白對(dui)照孔(kong)不加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)品(pin)及酶標試劑，其(qi)余各步操作相同(tong)）、待測(ce)樣(yang)(yang)品(pin)孔(kong)，在(zai)酶標包被板上待測(ce)樣(yang)(yang)品(pin)孔(kong)中(zhong)先(xian)加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)品(pin)稀(xi)釋(shi)液40μl，然后再加(jia)(jia)(jia)待測(ce)樣(yang)(yang)品(pin)10μl（樣(yang)(yang)品(pin)最(zui)終稀(xi)釋(shi)度為5倍）。加(jia)(jia)(jia)樣(yang)(yang)將(jiang)樣(yang)(yang)品(pin)加(jia)(jia)(jia)于酶標板孔(kong)底(di)部，盡量(liang)不觸及孔(kong)壁，輕輕晃動混勻(yun)。
2.溫育：用(yong)封板膜(mo)封板后置37℃溫育30分(fen)鐘。
3.配(pei)液：將30（48T的(de)20倍(bei)(bei)）倍(bei)(bei)濃縮洗滌(di)液用蒸餾水(shui)30（48T的(de)20倍(bei)(bei)）倍(bei)(bei)稀釋后備用。
4.洗滌(di)：小心(xin)揭掉封(feng)板(ban)膜，棄去(qu)液體，甩干，每孔加滿洗滌(di)液，靜置(zhi)30秒(miao)后棄去(qu)，如此重復5次，拍干。
5.加(jia)(jia)酶：每孔加(jia)(jia)入酶標試劑50μl，空白孔除外。
6.溫(wen)育：操作同(tong)2。
7.洗滌(di)：操作(zuo)同4。
8.顯色(se)：每(mei)孔(kong)先加(jia)入(ru)顯色(se)劑A50μl，再(zai)加(jia)入(ru)顯色(se)劑B50μl，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)震蕩(dang)混勻(yun)，37℃避(bi)光顯色(se)15分鐘.
9.終(zhong)止(zhi)：每孔(kong)加終(zhong)止(zhi)液50μl，終(zhong)止(zhi)反應(ying)（此時藍色立轉黃色）。
10.測定：以(yi)空(kong)白空(kong)調零，450nm波長依序測量(liang)各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以(yi)內(nei)進行(xing)。
注意事項：
1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平(ping)衡15-30分鐘(zhong)后(hou)方可使用，酶標包被板開封后(hou)如未用完，板條應裝入密封袋中保存(cun)。
2．濃洗(xi)滌液可能(neng)會有結(jie)晶析出(chu)，稀釋時可在(zai)水浴中加溫助溶，洗(xi)滌時不影響結(jie)果。
3．各步加樣均應(ying)使用(yong)加樣器(qi)，并經常校對(dui)其準確(que)性(xing)，以避(bi)免(mian)試驗誤差(cha)。一次加樣時間最好控(kong)制在(zai)5分鐘(zhong)內(nei)，如標(biao)本數(shu)量多，推薦(jian)使用(yong)排槍加樣。
4．請(qing)每次測定的同(tong)時做標(biao)準曲(qu)線，最好做復孔。如標(biao)本中待測物質含量過高(gao)（樣本OD值大于標(biao)準品孔第一孔的OD值），請(qing)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shu)（n倍）后(hou)再測定，計算時請(qing)最后(hou)乘以總稀釋倍數(shu)（×n×5）。
5．封板膜只限(xian)一(yi)次性使用，以(yi)避免交叉污(wu)染。
6．底物請(qing)避(bi)光(guang)保存。
7．嚴格按照說明(ming)書的操作(zuo)進(jin)行，試驗(yan)結(jie)果(guo)判(pan)定必須(xu)以酶標儀讀數(shu)為準.
8．所有樣品，洗滌(di)液和各種廢棄物都(dou)應按傳染物處理。
9．本試(shi)劑不同批號組分不得混用(yong)。
11.如與英(ying)文說(shuo)明書有異，以英(ying)文說(shuo)明書為準。
計算：
以標(biao)(biao)準物(wu)的濃(nong)度為橫(heng)坐標(biao)(biao)，OD值為縱坐標(biao)(biao)，在坐標(biao)(biao)紙上繪出標(biao)(biao)準曲線，根據樣(yang)品的OD
值由標(biao)準曲線查出相(xiang)應的濃度；再乘以稀釋倍數(shu)；或(huo)用標(biao)準物的濃度與OD值計(ji)算出標(biao)
準曲線(xian)(xian)的直線(xian)(xian)回(hui)歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再(zai)乘以(yi)稀釋
倍數，即為樣品(pin)的實(shi)際(ji)濃(nong)度。
試劑(ji)盒(he)性能：
1.樣品(pin)線性回歸與預期(qi)濃(nong)度(du)相關系數R值為0.990以上。
2.批內(nei)與(yu)批間應分別小于9%和11%
保存條件及有效(xiao)期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月
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