大鼠分泌型卷曲相關蛋白5(SFRP5)酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
實驗原理：
大(da)鼠分(fen)泌型卷曲(qu)相關(guan)蛋白5(SFRP5)試劑(ji)盒含(han)量(liang)是固相夾心法(fa)酶(mei)(mei)聯免疫吸附實(shi)驗（ELISA）.已(yi)知待測物(wu)質濃(nong)度的(de)(de)標準(zhun)品、未知濃(nong)度的(de)(de)樣品加入(ru)微(wei)孔酶(mei)(mei)標板(ban)內(nei)進行檢測。先將(jiang)待測物(wu)質和(he)(he)(he)生(sheng)物(wu)素標記(ji)的(de)(de)抗體同時(shi)溫育(yu)。洗滌后(hou)，加入(ru)親和(he)(he)(he)素標記(ji)過(guo)的(de)(de)HRP。再經過(guo)溫育(yu)和(he)(he)(he)洗滌，去除(chu)未結合(he)的(de)(de)酶(mei)(mei)結合(he)物(wu)，然后(hou)加入(ru)底物(wu)A、B，和(he)(he)(he)酶(mei)(mei)結合(he)物(wu)同時(shi)作(zuo)用。產生(sheng)顏(yan)色(se)。顏(yan)色(se)的(de)(de)深(shen)淺(qian)和(he)(he)(he)樣品中(zhong)待測物(wu)質的(de)(de)濃(nong)度呈比(bi)例關(guan)系。
試劑盒組成：
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試劑盒組成
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48孔配置
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96孔配置
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保存
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說明書
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1份
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1份
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封板膜
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2片（48）
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2片（96）
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密封袋
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1個
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1個
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酶標包被板
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1×48
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1×96
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2-8℃保存
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標準品
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0.5ml×1瓶
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0.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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標準品稀釋液
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1.5ml×1瓶
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1.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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酶標試劑
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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樣品稀釋液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑A液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑B液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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終止液
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3ml×1瓶
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6ml×1瓶
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2-8℃保存
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濃縮洗滌液
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（20ml×20倍）×1瓶
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（20ml×30倍）×1瓶
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2-8℃保存
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注：標(biao)準品(pin)用(yong)標(biao)準品(pin)稀釋液依次做倍比稀釋
標本要求：
1．標本采集(ji)后(hou)盡早進行(xing)提取，提取按相關文獻進行(xing)，提取后(hou)應盡快進行(xing)實驗(yan)。若(ruo)不(bu)能馬上進行(xing)試(shi)驗(yan)，可將標本放于-20℃保存，但(dan)應避免(mian)反復凍融
2．不能(neng)檢(jian)測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣(la)根過(guo)氧(yang)化(hua)物酶的（HRP）活性。
操作步驟:
1.加(jia)(jia)樣(yang)(yang)：標準(zhun)品(pin)(pin)(pin)設(she)定(ding)5個濃度(du)點10個孔，每個濃度(du)設(she)定(ding)平行孔，加(jia)(jia)入50微(wei)升不(bu)同濃度(du)的標準(zhun)品(pin)(pin)(pin)，空(kong)白(bai)孔設(she)定(ding)1個孔加(jia)(jia)入50微(wei)升蒸餾水（空(kong)白(bai)對照孔不(bu)加(jia)(jia)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)及酶標試劑，其余各步(bu)操作相同）、待測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)孔，在酶標包被板上待測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)孔中先加(jia)(jia)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)稀(xi)(xi)釋液(ye)40μl，然后再加(jia)(jia)待測樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)10μl（樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)最終稀(xi)(xi)釋度(du)為5倍）。加(jia)(jia)樣(yang)(yang)將樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)加(jia)(jia)于酶標板孔底(di)部，盡量不(bu)觸及孔壁(bi)，輕輕晃動混勻。
2.溫育：用封(feng)板(ban)膜封(feng)板(ban)后置37℃溫育30分鐘。
3.配液(ye)：將30（48T的(de)20倍）倍濃(nong)縮洗滌(di)液(ye)用蒸餾(liu)水30（48T的(de)20倍）倍稀釋后備用。
4.洗滌：小(xiao)心(xin)揭掉(diao)封板膜，棄(qi)去液(ye)體，甩(shuai)干(gan)，每孔加(jia)滿洗滌液(ye)，靜置30秒(miao)后棄(qi)去，如此重復5次，拍干(gan)。
5.加酶：每孔加入(ru)酶標試劑50μl，空白孔除外。
6.溫育：操(cao)作同2。
7.洗(xi)滌(di)：操作(zuo)同(tong)4。
8.顯(xian)色(se)：每(mei)孔先加(jia)入顯(xian)色(se)劑(ji)A50μl，再加(jia)入顯(xian)色(se)劑(ji)B50μl，輕(qing)輕(qing)震蕩(dang)混勻，37℃避光顯(xian)色(se)15分鐘.
9.終止：每孔(kong)加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
10.測(ce)定(ding)：以(yi)空白(bai)空調零(ling)，450nm波長(chang)依序(xu)測(ce)量(liang)各孔的(de)吸光度（OD值）。測(ce)定(ding)應在(zai)加終(zhong)止液后15分鐘(zhong)以(yi)內進行(xing)。
注意事項：
1．試劑盒從冷藏環(huan)境中取出應在(zai)室(shi)溫平衡15-30分鐘后(hou)方(fang)可(ke)使用(yong)(yong)，酶標包(bao)被板開封(feng)后(hou)如未用(yong)(yong)完，板條應裝(zhuang)入密封(feng)袋中保存(cun)。
2．濃洗滌(di)液可(ke)能會(hui)有結(jie)晶(jing)析出，稀釋時(shi)可(ke)在水浴(yu)中加(jia)溫助(zhu)溶，洗滌(di)時(shi)不影(ying)響結(jie)果。
3．各(ge)步加樣均應使用加樣器(qi)，并(bing)經常校對(dui)其準確(que)性(xing)，以避(bi)免試驗誤差。一(yi)次加樣時間(jian)最好控制在5分鐘(zhong)內，如標(biao)本數量多，推薦使用排槍加樣。
4．請(qing)每次測定(ding)的同(tong)時做標準曲線，最好做復(fu)孔。如標本中待測物(wu)質含量過高（樣(yang)本OD值(zhi)大于(yu)標準品孔第一孔的OD值(zhi)），請(qing)先用(yong)樣(yang)品稀釋(shi)液稀釋(shi)一定(ding)倍(bei)數(shu)（n倍(bei)）后再測定(ding)，計算時請(qing)最后乘以總稀釋(shi)倍(bei)數(shu)（×n×5）。
5．封板膜只限一(yi)次性(xing)使(shi)用，以避免交叉污染。
6．底物請避光(guang)保存(cun)。
7．嚴格(ge)按照說(shuo)明書的操作(zuo)進行，試驗結果判定必須以(yi)酶標(biao)儀讀數為準(zhun).
8．所(suo)有樣(yang)品，洗(xi)滌(di)液和各種廢棄物(wu)都應按(an)傳染物(wu)處理。
9．本試劑不同批號(hao)組(zu)分不得混用。
11.如與英文(wen)說明書(shu)有異(yi)，以英文(wen)說明書(shu)為準。
計算：
以標(biao)(biao)準物(wu)的濃度為橫坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)，OD值(zhi)為縱(zong)坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)，在坐(zuo)(zuo)標(biao)(biao)紙上繪(hui)出標(biao)(biao)準曲線(xian)，根據(ju)樣品的OD
值由標(biao)(biao)(biao)準曲線查出相應的(de)(de)濃度；再乘以(yi)稀釋倍數；或用標(biao)(biao)(biao)準物的(de)(de)濃度與OD值計算(suan)出標(biao)(biao)(biao)
準曲線的直(zhi)線回歸方(fang)程(cheng)式(shi)，將樣品(pin)的OD值代入方(fang)程(cheng)式(shi)，計算(suan)出樣品(pin)濃度(du)，再乘以(yi)稀釋
倍數，即為(wei)樣品的實際濃(nong)度。
試劑盒性能：
1.樣品線性(xing)回歸(gui)與預期濃(nong)度相關系數R值為0.990以上。
2.批內與(yu)批間(jian)應分別小于9%和11%
保(bao)存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月
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