兔血小板因子4(PF-4/CXCL4)酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
實驗原理：
兔(tu)血小板因子4(PF-4/CXCL4)試(shi)劑盒含(han)量(liang)是固相(xiang)夾心法酶(mei)聯(lian)免疫吸附(fu)實(shi)驗（ELISA）.已知待測(ce)(ce)物(wu)質濃(nong)度(du)的(de)標準品、未知濃(nong)度(du)的(de)樣品加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)微孔酶(mei)標板內(nei)進行檢測(ce)(ce)。先(xian)將(jiang)待測(ce)(ce)物(wu)質和(he)生物(wu)素標記的(de)抗體同(tong)時溫育。洗滌(di)后(hou)，加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)親(qin)和(he)素標記過的(de)HRP。再(zai)經過溫育和(he)洗滌(di)，去(qu)除未結(jie)合的(de)酶(mei)結(jie)合物(wu)，然后(hou)加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)底物(wu)A、B，和(he)酶(mei)結(jie)合物(wu)同(tong)時作用。產生顏(yan)色。顏(yan)色的(de)深(shen)淺和(he)樣品中待測(ce)(ce)物(wu)質的(de)濃(nong)度(du)呈比例關系
試劑盒組成：
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試劑盒組成
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48孔配置
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96孔配置
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保存
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說明書
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1份
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1份
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封板膜
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2片（48）
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2片（96）
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密封袋
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1個
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1個
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酶標包被板
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1×48
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1×96
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2-8℃保存
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標準品
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0.5ml×1瓶
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0.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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標準品稀釋液
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1.5ml×1瓶
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1.5ml×1瓶
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2-8℃保存
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酶標試劑
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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樣品稀釋液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑A液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑B液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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終止液
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3ml×1瓶
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6ml×1瓶
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2-8℃保存
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濃縮洗滌液
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（20ml×20倍）×1瓶
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（20ml×30倍）×1瓶
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2-8℃保存
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注：標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)用標(biao)(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)稀釋液依次做(zuo)倍比稀釋
標本要求：
1．標(biao)本采集后盡早進行(xing)提取(qu)(qu)，提取(qu)(qu)按相關文(wen)獻進行(xing)，提取(qu)(qu)后應(ying)盡快進行(xing)實驗(yan)。若不能馬上進行(xing)試(shi)驗(yan)，可將標(biao)本放(fang)于(yu)-20℃保存，但應(ying)避免反復凍融
2．不能(neng)檢(jian)測含(han)NaN3的樣品，因NaN3抑制(zhi)辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟:
1.加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)：標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)設(she)(she)(she)定5個濃(nong)度(du)點10個孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)，每個濃(nong)度(du)設(she)(she)(she)定平行孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)，加(jia)入(ru)50微(wei)升不(bu)同濃(nong)度(du)的標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)(pin)，空白孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)設(she)(she)(she)定1個孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)加(jia)入(ru)50微(wei)升蒸(zheng)餾水(shui)（空白對照(zhao)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)不(bu)加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)及酶(mei)標(biao)(biao)試劑，其余各步(bu)操作相同）、待測(ce)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)，在酶(mei)標(biao)(biao)包被板上待測(ce)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中先加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)稀釋液40μl，然后(hou)再加(jia)待測(ce)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)10μl（樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)最終稀釋度(du)為5倍）。加(jia)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)將(jiang)樣(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)加(jia)于(yu)酶(mei)標(biao)(biao)板孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)底部，盡量不(bu)觸及孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)壁，輕輕晃動混(hun)勻(yun)。
2.溫育：用封(feng)板膜封(feng)板后置37℃溫育30分鐘。
3.配液：將30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)濃縮洗滌液用蒸(zheng)餾水(shui)30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)稀釋后備(bei)用。
4.洗(xi)(xi)滌：小心(xin)揭掉封板膜(mo)，棄(qi)去液體，甩干，每孔加(jia)滿洗(xi)(xi)滌液，靜置30秒后棄(qi)去，如此重復(fu)5次，拍(pai)干。
5.加(jia)酶(mei)：每孔加(jia)入酶(mei)標(biao)試劑50μl，空白孔除(chu)外。
6.溫(wen)育：操作(zuo)同2。
7.洗滌：操作同4。
8.顯(xian)色(se)(se)：每(mei)孔先加入顯(xian)色(se)(se)劑A50μl，再加入顯(xian)色(se)(se)劑B50μl，輕輕震蕩混(hun)勻(yun)，37℃避(bi)光(guang)顯(xian)色(se)(se)15分鐘.
9.終(zhong)(zhong)止(zhi)：每孔加終(zhong)(zhong)止(zhi)液50μl，終(zhong)(zhong)止(zhi)反應(ying)（此時藍色(se)立轉(zhuan)黃色(se)）。
10.測(ce)(ce)定：以空白空調零(ling)，450nm波(bo)長依序測(ce)(ce)量各孔的吸光(guang)度(du)（OD值）。測(ce)(ce)定應在加終止(zhi)液后(hou)15分鐘以內(nei)進行。
注意事項：
1．試劑盒從冷藏環(huan)境(jing)中(zhong)取(qu)出應在室溫平衡(heng)15-30分鐘后(hou)方可使用(yong)，酶標包(bao)被(bei)板開(kai)封后(hou)如(ru)未用(yong)完，板條應裝(zhuang)入密封袋中(zhong)保存。
2．濃洗滌(di)液可能會有(you)結晶析出，稀釋(shi)時可在水(shui)浴中加溫(wen)助(zhu)溶(rong)，洗滌(di)時不影響結果。
3．各步(bu)加(jia)(jia)樣均應使用加(jia)(jia)樣器，并(bing)經常校對其準確性，以避免試(shi)驗誤差。一次(ci)加(jia)(jia)樣時間最好控制在5分鐘內，如標(biao)本數量(liang)多(duo)，推(tui)薦使用排(pai)槍加(jia)(jia)樣。
4．請(qing)每次(ci)測(ce)(ce)定的(de)同時(shi)做標(biao)準(zhun)曲線，最(zui)好做復孔(kong)。如(ru)標(biao)本中(zhong)待測(ce)(ce)物質含量過高（樣本OD值(zhi)大于標(biao)準(zhun)品孔(kong)第一(yi)孔(kong)的(de)OD值(zhi)），請(qing)先用樣品稀(xi)釋(shi)液(ye)稀(xi)釋(shi)一(yi)定倍(bei)數（n倍(bei)）后(hou)再(zai)測(ce)(ce)定，計算時(shi)請(qing)最(zui)后(hou)乘以總稀(xi)釋(shi)倍(bei)數（×n×5）。
5．封板膜只限一次(ci)性使(shi)用，以避免交叉污染。
6．底物(wu)請(qing)避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行(xing)，試(shi)驗(yan)結果判定必須(xu)以(yi)酶標儀(yi)讀(du)數為準(zhun).
8．所(suo)有樣品，洗滌液和各種廢(fei)棄物都應按傳(chuan)染物處理。
9．本試劑不(bu)同批號組分(fen)不(bu)得(de)混(hun)用。
11.如與英(ying)文說明(ming)(ming)書有(you)異，以(yi)英(ying)文說明(ming)(ming)書為準。
計算：
以標(biao)(biao)準(zhun)物的濃(nong)度為橫坐標(biao)(biao)，OD值為縱坐標(biao)(biao)，在坐標(biao)(biao)紙上繪出標(biao)(biao)準(zhun)曲線，根據樣品的OD
值(zhi)由標(biao)準曲線查出(chu)相應(ying)的濃度；再乘以稀釋倍(bei)數；或用標(biao)準物的濃度與OD值(zhi)計算出(chu)標(biao)
準曲線(xian)(xian)的(de)直線(xian)(xian)回歸方(fang)程式，將(jiang)樣(yang)品(pin)的(de)OD值(zhi)代(dai)入方(fang)程式，計算出樣(yang)品(pin)濃度，再(zai)乘以稀釋
倍數，即為樣品的實際濃度(du)。
試(shi)劑盒性能：
1.樣(yang)品線性回(hui)歸(gui)與預期濃度(du)相(xiang)關系數R值為0.990以(yi)上。
2.批內與批間(jian)應分別(bie)小于9%和11%
保存條件及有效期：
1.試劑盒保(bao)存：；2-8℃。
2．有效期：6個月
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