如何快速(su)高效(xiao)進行突變(bian)(bian)體(ti)檢測和鑒(jian)定(ding)是(shi)植物(wu)基因(yin)組(zu)編輯技術迅(xun)速(su)發展面臨的(de)重(zhong)要問題之(zhi)一。目前(qian)植物(wu)基因(yin)組(zu)編輯突變(bian)(bian)檢測方法(fa)主(zhu)要包(bao)括PCR/RE、T7EI錯配切割(ge)、臨界退火(huo)溫度PCR (ACT-PCR)、Sanger測序(xu)和二代測序(xu)(NGS)等(deng)。以(yi)上所有(you)的(de)檢測方法(fa)都基于(yu)PCR反應，且都有(you)各自的(de)不足之(zhi)處。PCR/RE方法(fa)的(de)需要設(she)計含有(you)限制性內切酶位(wei)點的(de)靶(ba)位(wei)點；T7EI無法(fa)區分純合突變(bian)(bian)體(ti)和野(ye)生型以(yi)及雜合突變(bian)(bian)體(ti)與(yu)雙等(deng)位(wei)突變(bian)(bian)體(ti)；ACT-PCR對PCR反應條件要求極高，而且無法(fa)檢測到雜合突變(bian)(bian)；Sanger測序(xu)和NGS的(de)價格比較昂貴，尤其是(shi)對于(yu)數目比較大的(de)群體(ti)。

針對(dui)上述(shu)問題，中國科學院(yuan)遺傳與發育生(sheng)(sheng)物學研究所(suo)高(gao)彩霞研究組利用(yong)CRISPR/Cas系(xi)統(包括(kuo)Cas9和(he)(he)Cpf1)的體(ti)外切(qie)割特性，在(zai)六倍體(ti)小(xiao)麥(mai)和(he)(he)二倍體(ti)水稻中建(jian)立了一(yi)種(zhong)簡單(dan)、高(gao)效、廉(lian)價(jia)的PCR/RNP植物突變體(ti)篩選(xuan)(xuan)(xuan)策略。該(gai)方(fang)(fang)(fang)法(fa)(fa)不(bu)受限制性內(nei)切(qie)酶位點的限制，比PCR/RE具(ju)有(you)更(geng)強的廣適(shi)性；比T7EI具(ju)有(you)更(geng)高(gao)的準(zhun)確度；比Sanger測序更(geng)廉(lian)價(jia)，而(er)且(qie)靈敏度更(geng)高(gao)。基(ji)于(yu)SpCas9和(he)(he)FnCpf1 RNPs的PCR/RNP方(fang)(fang)(fang)法(fa)(fa)可以(yi)(yi)用(yong)于(yu)檢(jian)測基(ji)因(yin)組編(bian)輯(ji)(ji)中經NHEJ修復產生(sheng)(sheng)的所(suo)有(you)indel突變；基(ji)于(yu)FnCpf1 RNPs的PCR/RNP方(fang)(fang)(fang)法(fa)(fa)可以(yi)(yi)用(yong)于(yu)檢(jian)測位于(yu)種(zhong)子區域(seed region)內(nei)的SNP突變。該(gai)方(fang)(fang)(fang)法(fa)(fa)尤其適(shi)用(yong)于(yu)小(xiao)麥(mai)的瞬(shun)時(shi)表(biao)達基(ji)因(yin)組編(bian)輯(ji)(ji)體(ti)系(xi)，如該(gai)實驗室之前(qian)建(jian)立的CRISPR/Cas9 IVTs和(he)(he)RNPs介導(dao)的DNA-free基(ji)因(yin)組編(bian)輯(ji)(ji)體(ti)系(xi)。這是由于(yu)瞬(shun)時(shi)表(biao)達基(ji)因(yin)組編(bian)輯(ji)(ji)體(ti)系(xi)在(zai)后(hou)續(xu)組織(zhi)培養過程中不(bu)使用(yong)任何的篩選(xuan)(xuan)(xuan)標記，在(zai)T0代會獲得(de)較(jiao)多的待篩選(xuan)(xuan)(xuan)植株，而(er)且(qie)PCR/RNP方(fang)(fang)(fang)法(fa)(fa)可以(yi)(yi)使用(yong)通用(yong)引(yin)物對(dui)發生(sheng)(sheng)在(zai)小(xiao)麥(mai)A組、B組和(he)(he)D組各拷貝的突變進行同(tong)時(shi)檢(jian)測，不(bu)會受靶位點周圍SNPs的影響。此外，PCR/RNP方(fang)(fang)(fang)法(fa)(fa)也可以(yi)(yi)用(yong)于(yu)檢(jian)測TALEN蛋白所(suo)誘導(dao)的突變。

該研究成果于5月3日在線發表于Plant Biotechnology Journal 雜志上(DOI: 10.1111/pbi.12938)。高彩霞研究組博士生梁振為該論文的第一作者。相關研究得到科技部、北京市科委、中科院以及國家自然基金委的資助。